Основні способи поширення і передачі вірусів у рослинництві

4 см | ЗМ, _ 3% > й | — `, ут у 3 и 9.1.1. Поширення та зберігання вірусів

Віруси, що викликають хвороби рослин, можуть поширюватися різними шляхами. Можлива передача контактно-механічним шляхом, тобто при взаємопошкоджувальному контакті частин здорової та хворої рослин. Це відбувається при торканні надземних або підземних частин рослин під час загущеного садіння, а також у процесі догляду за рослинами (обламування пасинків, зрізування квітів, збирання плодів тощо).

Доволі багато вірусів передається з насінням. Це віруси бобових рослин (мозаїка квасолі, мозаїка сої), мозаїки томата (ТоБМУ), зеленої крапчастої мозаїки огірка (ССММУ). Причому розрізняють поверхневу та внутрішню насіннєву інфекцію. Віруси можуть потрапляти в насіння також через пилок у процесі запилення рослин, але цей спосіб передачі достовірно доведено лише для небагатьох вірусів (переважно плодових культур).

Для вегетативно розмножуваних культур основним способом поширення вірусів є посадковий матеріал. При щепленнях (трансплантації) відбувається поширення вірусних хвороб. Цим методом передаються всі відомі фітопатогенні віруси.

Поодинокі віруси (вірус мозаїки тютюну, вірус некрозу тютюну) можуть передаватися з рослинними рештками, з ґрунтом, з гідропонним розчином.

Багато фітопатогенних вірусів поширюються безхребетними з колючо-сисним ротовим апаратом, головним чином попелицями, а також цикадками, трипсами, клопами, білокрилками, жуками, кліщами та нематодами. Механізм поширення вірусів переносниками неоднаковий, і залежно від особливостей передачі віруси ділять на персистентні та неперсистентні.

Переносниками, як правило, є спеціалізовані види, найчастіше попелиці, рідше — цикадки, трипси, клопи, кліщі. Ґрунтові нематоди, що паразитують на коренях рослин, часто є переносниками низки вірусів плодових, ягідних, квіткових культур. Є дані про поширення деяких вірусів ґрунтовими грибами. Установлено, що віруси некрозу тютюну та огірка передаються зооспорами Olpidium brassicae, X-вірус картоплі (PVX) — збудником раку картоплі (Synchytrium endobioticum).

Неперсистентні віруси поширюються переважно за рахунок прикріплення вірусних частинок до поверхні стилету колючо-сисного апарату. Неперсистентні віруси можуть бути передані переносником протягом обмеженого проміжку часу, часто не більше години, надалі швидкість передачі знижується. Причому переносник, що харчується на хворій рослині, отримує такий вірус, тобто стає вірофорним дуже швидко — з перших же секунд, рідше хвилин. Після линяння переносника інфекційність втрачається. До неперсистентних вірусів належать Y-вірус картоплі (PVY), вірус мозаїки гороху, звичайної мозаїки огірка та ін.

При персистентному способі поширення переносник, харчуючись на зараженій рослині, стає вірофорним через кілька годин або днів і зберігає інфекційність понад 100 год, а іноді все життя. Ця особливість зберігається незалежно від линяння.

Потрапляючи із соком рослини в травну систему комахи-переносника, віруси надходять у гемолімфу, а звідти в слинні залози, де можуть навіть розмножуватися (пропагативні віруси). Деякі віруси (вірус бронзовості томата, мозаїки гарбуза, скручування листя картоплі) здатні передаватися трансоваріально, тобто зараженими виявляються наступні покоління комах.

Існує і напівперсистентний спосіб передачі. У цьому випадку переносник зберігає вірофорність від 10 до 100 год. Таким способом переноситься PLRV (M-вірус картоплі).

Більшість вірусів перезимовують у живих частинах багаторічних культурних рослин або бур'янів (зокрема, у коренеплодах, коренях, цибулинах, живцях тощо). Передача їх з року в рік згодом призводить до різкого зниження продуктивності рослин і виродження сорту. Деякі віруси зберігаються в тілі переносників, інші зберігаються на поверхні або всередині насіння.

Найстійкіші віруси, такі як вірус мозаїки тютюну (ТоБМУ) та зеленої мозаїки огірка (ССММУ), здатні тривалий час зберігатися на рослинних рештках, у субстраті, в оборотній поливній воді крапельних систем.

Кілька прикладів:

• Вірус тютюнової мозаїки (ВТМ, ТоБМУ) — передається з насінням томатів. Крім того, джерелом інфекції служать рослинні рештки з ВТМ у ґрунті, в якому вірус зберігається тривалий час завдяки своїй стабільності. Збудник може зберігатися також на конструкціях теплиць, на робочому одязі та інструментах. Резервується на багатьох видах культурних та диких рослин, що ростуть поблизу теплиць.
• X-вірус картоплі (PVX) — може передаватися з насінням. Джерелом зараження можуть бути також бульби картоплі та тара, завезені в теплиці.
• Вірус огіркової мозаїки (CMV) — передається багатьма видами сисних шкідників: попелицями, трипсами, білокрилками. Резерваторами можуть бути різні види багаторічних та однорічних рослин, у тому числі огірок.
• Вірус скручування листя картоплі (PLRV). Як його переносники відомі різні види попелиць. Установлено, що цей вірус передається з насінням томата, хоча раніше для PLRV передача механічним шляхом і насінням була невідома. Вірус уражує культурні рослини, переважно однорічні, в помірних зонах, поширений переважно на картоплі.

У природі виживають ті штами вірусу, які інтенсивно розмножуються, але разом з тим не завдають своїм господарям серйозних пошкоджень, здатних викликати загибель рослини. У результаті заражена рослина стає резерватором вірусу, який легко поширюється переносниками серед насаджень.

У молодому віці рослини найбільш схильні до вірусних інфекцій і водночас найбільш привабливі для шкідників, зокрема переносників захворювань. Цю особливість треба враховувати при визначенні строків сівби культур і проведення захисних робіт проти шкідників. У ряді випадків це дає можливість запобігти розвитку вірозів.

У міру росту і старіння рослини набувають стійкості. Швидкість поширення захворювань у посадках старих рослин зменшується не лише за рахунок їхньої більшої стійкості, а й тому, що розмноження і системне поширення вірусів відбувається повільніше.

Рослини, вирощені за всіма правилами агротехніки, більш чутливі до зараження.

Швидкість поширення вірусів серед посадок залежить від біологічних особливостей переносників. Так, встановлено, що крилаті самки оранжерейні попелиці віддають перевагу рослинам із хлоротичним забарвленням. На таких рослинах життєздатність шкідника зростає:

що, зрештою, призводить до більшого зростання чисельності переносників. 1.1.2. Методи діагностики вірусних хвороб

Візуальна діагностика. Хоча в ряді випадків і вдається достовірно встановити вірусну природу захворювання за зовнішніми ознаками (наприклад, кільцеві або лінійні хлоротичні візерунки на молодому листі), їхня ідентифікація ускладнена у зв'язку з безсимптомним (латентним) характером розвитку хвороб.

Симптоматика залежить від стану організму, агресивності штаму патогену, зовнішніх умов і тривалості перебування вірусу в клітинах господаря. Наприклад, симптоми захворювання чітко виражені у рослин, що росли на яскравому світлі і при помірній температурі; при високій температурі та недостатньому освітленні симптоматика захворювання може бути зовсім не виражена.

Посвітління жилок наймолодшого листя нерідко є однією з перших ознак системної вірусної інфекції. Жилки стають жовтими і напівпрозорими. Листки, що утворюються пізніше, можуть бути:

• мозаїчними;
• крапчастими;
• зовсім жовтими (хлоротичними).

Інкубаційний період захворювання залежить від виду вірусу, рослини-господаря та умов середовища, але, у будь-якому разі, він становить кілька днів або тижнів.

Якщо перші симптоми вірозу помітні на розсаді, то джерело інфекції знаходилося або в насінні, або зараження відбулося за посередництва переносника. Якщо заражені рослини розташовані в культурі цілком випадково або ж лише в рядках, посаджених з однієї партії, то це свідчить про те, що, швидше за все, був заражений посадковий матеріал. Якщо на окремих ділянках поля виявляються хворі рослини, причому поява заражених ділянок пов'язана з ґрунтовими відмінностями, є всі підстави припускати поширення вірусів через ґрунт.

Хотілося б зазначити також, що існують симптоми, які нагадують ураження вірусами, але викликані іншими причинами. Подібні симптоми ураження мають фітоплазми і деякі бактерії.

Точкові некрози, викликані ураженнями рослин попелицями та кліщами, також нерідко плутають із вірозами, наприклад, велика картопляна попелиця викликає скручування, деформацію і місцевий хлороз листя огірка. До появи симптомів, подібних до вірусної інфекції, часто призводять звичайні порушення мінерального живлення (наприклад, пов'язані з дефіцитом заліза). Різні деформації органів можуть викликати гербіциди гормональної природи.

Таким чином, точна ідентифікація за зовнішніми ознаками ураження вірусами неможлива, однозначну відповідь може бути отримано лише з використанням інструментальних методів (імуноферментний аналіз, РСВ-аналіз тощо).

Метод індикаторних рослин є широко поширеним методом діагностики вірусних хвороб та ідентифікації вірусів. Він ґрунтується на використанні тест-рослин (індикаторних), що дають чіткі, часто суворо специфічні стосовно певного виду вірусу симптоми. Зараження трав'янистих рослин-індикаторів здійснюють механічною інокуляцією соком. Зараження проявляється у вигляді місцевих некрозів, рідше системною реакцією (зміною забарвлення, пригніченням росту). Для вірусу аспермії томата як індикатор можна використовувати молоді рослини тютюну (Nicotiana glutinosa), для діагностики Х-вірусу картоплі — амарант кулястий (Gomphrena globosa). У ряді випадків для зараження можна використовувати окремі ізольовані листки рослин-індикаторів. Соконепереносні віруси переносять на індикаторні рослини методом щеплення; так, для діагностики вірусів суниці використовують щеплення черешком листка на індикаторні клони суниці лісової (Fragaria vesca). Рідко для передачі вірусів використовують комах-переносників та рослину-паразит повитицю.

Серологічна діагностика. Якщо теплокровній тварині ввести у кров очищений препарат рослинного вірусу, імунний апарат тварини у відповідь на введення чужорідного білка (антигену) почне виробляти специфічні до нього антитіла, що зв'язують антиген. В результаті реакції утворюється осад (преципітат, або серум), що розрізняється візуально або за допомогою мікроскопа.

Методи діагностики: як виявити вірусну інфекцію

Для точної ідентифікації вірусів у рослинництві використовують лабораторні та експрес-методи. Вони дозволяють виявити патоген на ранніх стадіях, визначити його вид і навіть штам. Вибір методу залежить від будови вірусу, його концентрації в тканинах і наявного обладнання.

Для швидкої оцінки в польових лабораторіях застосовують прості серологічні тести. Крапельний метод дозволяє змішати сік рослини з антисироваткою на предметному склі й оцінити реакцію через кілька хвилин візуально або під мікроскопом. Метод адсорбції підвищує наочність: антитіла заздалегідь зв'язують з латексом або іншим грубодисперсним матеріалом, що при контакті з вірусом дає добре помітну аглютинацію всього комплексу.

При роботі зі складними або дрібними вірусами використовують методи дифузії в гелі. При подвійній дифузії антисироватка і очищений сік рухаються назустріч один одному в агарі, утворюючи лінії преципітації. При радіальній імунодифузії антисироватку вводять прямо в гель, а лунки заповнюють соком, отримуючи при позитивній реакції преципітати у вигляді кілець.

Найбільш точним кількісним методом залишається імуноферментний аналіз (ІФА). Цей метод ґрунтується на використанні специфічних ферментних міток — фосфатази або пероксидази.

1. У лунки полімерної мікроплати додають антисироватку і очищений сік рослини для проходження першої імунної реакції.
2. На отриманий фіксований комплекс антиген-антитіло наносять розчин антитіл, зв'язаних із ферментом (фосфатазою або пероксидазою).
3. Мічені ферментом антитіла нашаровуються на детермінанти молекул антигену, забезпечуючи другу імунну реакцію.
4. Після додавання відповідного ферментного субстрату запускається реакція каталітичного розщеплення, яку реєструють за допомогою фотометра за кольоровою реакцією.

Для глибоких структурних досліджень застосовують електронну мікроскопію. Трансмісійний мікроскоп дозволяє розглянути форму, розміри і будову вірусу в ультратонких зрізах уражених частин рослин. Метод імуноелектронної мікроскопії допомагає вести серійні аналізи, виявляючи вірусні частинки з антитілами, що нашарувалися на них, безпосередньо в соку.

Молекулярні методи аналізу ґрунтуються на вивченні нуклеїнових кислот патогенів. Метод ДНК-зондів розпізнає конкретні ділянки вірусної РНК за принципом комплементарності, що дозволяє розрізняти групи, види і штами вірусів. При молекулярно-біологічному аналізі за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) ферменти багаторазово копіюють видоспецифічні ділянки РНК, після чого їх виявляють електрофорезом або імунофлуоресценцією.

• Сила струму для розділення нуклеїнових кислот у гелі — 3 мА
• Сила струму для розділення білків вірусу в гелі — 6 мА
• Збільшення копій фрагментів РНК у ході ПЛР — у мільйони разів

Окремі методи включають аналіз клітинних структур під світловим мікроскопом (метод включень). Накопичення вірусів у клітинах епідермісу або волосків листка призводить до утворення скупчень (кристалів Івановського) характерної форми. Для вірусу тютюнової мозаїки характерні голчасті та гексагональні кристали, а для Х-вірусу картоплі — сферичні аморфні тіла. Для виявлення зеленої крапчастої мозаїки огірка та скручування листя картоплі також використовують хімічні аналітичні методи діагностики.

Стратегія захисту: чому хімія безсила і як діяти агроному

Віруси постійно присутні в рослинних організмах. Самі по собі вони можуть не викликати загибелі господаря, але при виникненні стресових умов їхня шкідливість різко зростає. Рослини намагаються захищатися самостійно, реагуючи на інфекцію появою некрозів, мозаїк і деформацій органів, що веде до падіння врожайності та погіршення якості продукції.

З огляду на відсутність ефективних терапевтичних препаратів захист посівів і садінь має виключно превентивний характер. Боротьба з вірусними захворюваннями у польових умовах будується на попередженні зараження. На практиці агрономи використовують вакцинацію рослин слабопатогенними штамами вірусів і знижують швидкість розвитку вірусних епіфітотій за допомогою комплексу агротехнічних прийомів.

• При вегетативному розмноженні проводять періодичну прочистку посадок маточних рослин. Цей метод ефективний для боротьби з вірусами, що мають добре помітні симптоми.
• Обстеження молодих рослин і вибракування уражених рослин з метою знищення первинних вогнищ інфекції. Ретельне обстеження рослин у період сходів, початку цвітіння та початку плодоношення.
• Термотерапія дозволяє різко знизити зараженість, а іноді й повністю позбавити рослини від вірусів. Цей метод можна використовувати як для знезараження вегетативних органів, так і для боротьби з інфекцією всередині насіння. Температурні режими суворо специфічні і розглядаються нижче у відповідних розділах.
• Використання методу культивування апікальних меристем дозволяє позбутися більшості збудників вірозів. Найкращий ефект оздоровлення від вірусних інфекцій отримують при комбінуванні методу культури верхівкових меристем з попередньою термотерапією або хіміотерапією, при якій у поживне середовище для культивування меристем вводять антивірусні добавки (глікопротеїни, полісахариди, нуклеїнові кислоти, антибіотики вищих рослин) або обробляють ними вихідні рослини-донори меристем.
• Боротьба з рослинами — резервуарами вірусів, з переносниками інфекції. Скорочення запасу вірусів в об'єктах навколишнього середовища (у насінні та в самих рослинах, боротьба з переносниками інфекції).
• Використання імунних сортів і гібридів. При цьому селекційну роботу слід проводити не тільки за ознакою стійкості до вірусу, але, бажано, і до його переносника. Не менше значення має отримання толерантних (витривалих) сортів, у яких системне поширення вірусів обмежене, знижена їх концентрація. Толерантність часто призводить до безсимптомного перебігу захворювання, при цьому продуктивність рослин практично не знижується.
• Стимулювання у рослин неспецифічного імунітету за допомогою еліситорів (індукторів).
• Преімунізація, або вакцинація. Відомо, що вірулентні штами не викликають симптоми захворювання, якщо рослина попередньо була заражена слабопатогенним або авірулентним штамом вірусу.

Подібна вакцинація використовувалася раніше для захисту нестійких до ВТМ сортів і гібридів томата. Однак, в цілому преімунізація не набула широкого застосування через можливість мутування патогену, посилення його шкідливості при спільному зараженні з іншими патогенами та через низку інших причин. Проте останніми роками отримано хороші вакцини не тільки до ВТМ, а й до вірусу зеленої крапчастої мозаїки огірка.

Зміна геному рослин за рахунок включення нових генів стійкості, отриманих від донорів. При введенні в клітини гена, що відповідає за синтез білка оболонки вірусу тютюнової мозаїки, він викликає появу стійкості тютюну до цього захворювання. Так, трансгенні кабачки, що несуть гени вірусних оболонок жовтої мозаїки кабачка і мозаїки гарбуза, не мали симптомів ураження вірусами, тоді як контрольні рослини і трансгенні рослини з одним геном мали явні пошкодження.

Проведені польові випробування стійких до вірусів рослин томатів, картоплі та багатьох інших культур, отриманих при використанні цього підходу, показали його ефективність і перспективність подальших досліджень у цій галузі.

Державний і внутрішньогосподарський карантин. При імпорті рослин у сертифікаційному свідоцтві має бути підтверджено, що матеріал не містить карантинних об'єктів. Ефективність заходів зовнішнього і внутрішнього карантину значною мірою залежить від надійності та швидкості методів ідентифікації вірусів.

Організаційно-господарські заходи включають дезінфекцію ріжучих інструментів і знарядь праці в розчині формаліну, перманганату калію, спирту або їх теплову обробку, оскільки багато економічно значущих вірусів передаються контактним шляхом; робота у змінному взутті та одязі; розміщення дезінфекційних килимків перед входом у теплицю; регулярне проведення візуальних обстежень рослин.

Ослаблення симптомів захворювання за рахунок підтримки оптимального режиму вирощування культури, у тому числі мінерального живлення. У період розвитку епіфітотії рослини обприскують розчинами мікроелементів, фосфорними та калійними добривами, які стимулюють раннє дозрівання рослин і як наслідок — настання вікової стійкості.

Останні три способи разом є основою так званих профілактичних заходів. 1.2. Віроїди

Це порівняно нова група вірусоподібних фітопатогенів. Фактично віроїди складаються з однієї циклічної молекули РНК, яка здатна реплікуватися в рослині за рахунок біосинтетичних механізмів рослини-господаря. Віроїдна РНК складається з 250-400 нуклеотидів і має унікальну структуру. Це — кільцева молекула з високим відсотковим вмістом спарених основ, внаслідок чого віроїди стійкі до високих температур (понад 100°) і хімічних речовин (фенол, спирти та ін.). Віроїдні захворювання були відомі раніше, але їх розглядали як вірусні або як хвороби з нез'ясованою етіологією.

Віроїди — високоінфекційні патогени, здатні передаватися механічно і через щеплення, пилком та насінням, комахами і такою рослиною-паразитом, як повитиця. Вони інфікують переважно культурні рослини з класу дводольних. Ефективних засобів боротьби із захворюванням практично немає. Ця група патогенів більшою мірою небезпечна для багаторічних і вегетативно розмножуваних рослин.

Поширенню віроїдних хвороб сприяє складність виявлення патогена у зразках вихідного садивного матеріалу, у тому числі ввезеного з-за кордону. У селекційних і генетичних роботах можлива передача віроїдів з пилком і насінням. Ці захворювання завдають шкоди цитрусовим, хризантемі, томату, огірку, баклажану.

Томат може інфікуватися віроїдною веретеноподібністю бульб картоплі (ВВБК), віроїдом екзокортису цитрусових, а також віроїдами томатів планта мачо і апікальної карликовості. У Голландії, а потім в інших країнах відзначено віроїдне захворювання огірка — блідість плодів, яке помітно проявляється в літні місяці на довгоплідних партенокарпічних гібридах. Останніми роками все частіше виявляється латентне ураження баклажана, бобів, огірка віроїдами екзокортису цитрусових і карликовості хмелю. Загалом відомості про поширення і шкідливість віроїдних хвороб на овочевих культурах поки що нечисленні.

Діагностику віроїдів проводять за допомогою рослин-індикаторів, а також використовують методи визначення їхніх нуклеїнових кислот: електрофорез у поліакриламідному гелі (ПААГ), молекулярну гібридизацію, полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР).

Основна спрямованість захисту від віроїдів — профілактичні заходи: використання здорового садивного матеріалу, дезінфекція інструментів, вибракування заражених рослин тощо. Важливо враховувати, що рослини, уражені віроїдами, не можна звільнити від інфекції методами апікальної меристеми.

Бактерії і фітоплазми відносять до прокаріотів, тобто в клітинах цих організмів немає справжнього ядра. Кільцева молекула ДНК розташовується в особливій зоні клітини, що називається нуклеоїдом. За будовою клітинної стінки прокаріоти істотно відрізняються від ядерних організмів — еукаріот. У складі клітинних стінок прокаріот відсутні хітин і целюлоза, характерні для клітин грибів або рослин. Опорний каркас їхніх клітинних стінок утворений глікопептидом муреїном.

Бактерії — одноклітинні організми. Довжина бактеріальної клітини 1-3 мкм і ширина 0,3-0,6 мкм. Майже всі фітопатогенні бактерії (ФПБ) мають паличкоподібну форму (виняток — Streptomyces, які мають нитчасту будову). Більшість ФПБ рухливі завдяки наявності джгутиків, нерухомих форм небагато. Бактерії можуть мати один або кілька джгутиків. Залежно від кількості і розташування джгутиків усі рухливі бактерії ділять на монотрихів — з одним полярним джгутиком, лофотрихів — з пучком джгутиків на одному з кінців клітини і перитрихів — із джгутиками, розташованими по всій поверхні клітини. У більшості рухливих ФПБ джгутики полярні, рідше зустрічається перитрихальне їх розташування.

Нуклеоїд бактеріальної клітини складається з ДНК і розподілений у цитоплазмі у вигляді дрібних зерен, не відокремлений від цитоплазми мембраною. Бактеріальна клітина оточена порівняно товстою багатошаровою оболонкою — клітинною стінкою, внутрішній опорний шар якої надає бактерії певної форми.

За несприятливих умов середовища, наприклад під впливом антибіотиків, у деяких видів утворюються так звані Г-форми без клітинних стінок, які, проте, за певних умов можуть відновлювати свою первісну будову.

Оболонка деяких ФПБ вкрита тонким слизовим шаром з екзополісахаридів, який має здатність набухати, в результаті чого утворюється капсула. Слизова капсула має велике значення для виживання бактерій у несприятливих умовах, вони стають стійкими до дії сонячних променів, хімічних речовин та інших факторів. У вологу погоду бактеріальні клітини розмножуються на поверхні органів рослин і накопичуються у вигляді скупчень слизу або ексудату.

На особливостях будови клітинної стінки бактерій заснований важливий метод їхньої ідентифікації — забарвлення за Грамом. Суть цього методу — фарбування фіксованих бактеріальних клітин розчином кристал-віолету і грамйоду з подальшим знебарвленням етиловим спиртом, після чого в одних видів барвник вимивається зі стінок, і вони знебарвлюються (грамотрицательні бактерії), а в інших барвник міцно зв'язується клітинною стінкою. В результаті клітини набувають синього кольору (грампозитивні бактерії). Майже всі ФПБ грамотрицательні, лише види родів Clavibacter і Streptomyces дають позитивну реакцію.

ФПБ здатні розмножуватися при 5-10°, оптимальна температура — 25-30°, з підвищенням температури до 35-40° розмноження бактерій припиняється. ФПБ для активної життєдіяльності потрібне нейтральне або слаболужне середовище, що відрізняє їх від грибів, для росту яких сприятливе кисле середовище.