Основные способы распространения и передачи вирусов в растениеводстве

4 см | ЗМ, _ 3% > й | — `, ут у 3 и 9.1.1. Распространение и сохранение вирусов

Вирусы, вызывающие болезни растений, могут распространяться различными путями. Возможна передача контактно-механическим путем, т.е. при взаимоповреждающем контакте частей здорового и больного растений. Это происходит при соприкосновении надземных или подземных частей растений при загущенной посадке, а также в процессе ухода за растениями (обламывание пасынков, срезка цветов, сбор плодов и т.п.).

Довольно много вирусов передается с семенами. Это вирусы бобовых растений (мозаика фасоли, мозаика сои), мозаики томата (ТоБМУ), зелёной крапчатой мозаики огурца (ССММУ). Причем различают поверхностную и внутреннюю семенную инфекцию. Вирусы могут попадать в семена также через пыльцу в процессе опыления растений, но этот способ передачи достоверно доказан лишь для немногих вирусов (преимущественно плодовых культур).

Для вегетативно размножаемых культур основным способом рас-Ространения вирусов является посадочный материал. При прививках (трансплантации) происходит распространение вирусных болезней. Этим методом передаются все известные фитопатогенные вирусы.

Единичные вирусы (вирус мозаики табака, вирус некроза табака) могут передаваться с растительными остатками, с почвой, с гидропонным раствором.

Многие фитопатогенные вирусы распространяются беспозвоночными с колюще-сосущим ротовым аппаратом, главным образом тлями, а также цикадками, трипсами, клопами, белокрылками, жуками, клещами и нематодами. Механизм распространения вирусов переносчиками неодинаков, и в зависимости от особенностей передачи вирусы делят на пер-систентные и неперсистентные.

Переносчиками, как правило, являются специализированные виды, чаще всего тли, реже — цикадки, трипсы, клопы, клещи. Почвенные нематоды, паразитирующие на корнях растений, часто являются переносчиками ряда вирусов плодовых, ягодных, цветочных культур. Имеются данные о распространении некоторых вирусов почвенными грибами Установлено, что вирусы некроза табака и огурца передаются зооспорами Оф ит Бгазясае, Хроаю мти$ (РХУ) картофеля — возбудителем рака картофеля (Зупспуй ит епао ойсит).

Неперсистентные вирусы распространяются в основном за счёт прикрепления вирусных частиц к поверхности стилета колюще-сосущего аппарата. Неперсистентные вирусы могут быть переданы переносчиком в течение ограниченного промежутка времени, часто не более часа, в дальнейшем скорость передачи снижается. Причем переносчик, питающийся на больном растении, получает такой вирус, то есть становится вирофорным очень быстро — с первых же секунд, реже минут. После линьки переносчика инфекционность утрачивается. К неперсистентным вирусам относятся У-роаю мти$ (РУУ), вирус мозаики гороха, обыкновенной мозаики огурца и др.

При персистентном способе распространения переносчик, питаясь на заражённом растении, становится вирофорным через несколько часов или дней и сохраняет инфекционность более 100 ч, а иногда всю жизнь. Эта особенность сохраняется независимо от линьки.

Попадая с соком растения в пищеварительную систему насекомого-переносчика, вирусы поступают в гемолимфу, а оттуда в слюнные железы, где могут даже размножаться (пропагативные вирусы). Некоторые вирусы (вирус бронзовости томата, мозаики тыквы, скручивания листьев картофеля) способны передаваться трансовариально, т.е. заражёнными оказываются последующие поколения насекомых.

Существует и полуперсистентный способ передачи. В этом случае переносчик сохраняет вирофорность от 10 до 100 ч. Таким способом переносится РМУ (М-вирус картофеля).

Большинство вирусов перезимовывают в живых частях многолетних культурных растений или сорняков (в частности, в корнеплодах, корнях, луковицах, черенках и т.п.). Передача их из года в год потом приводит к резкому снижению продуктивности растений и вырождению сорта. Некоторые вирусы сохраняются в теле переносчиков, другие храняются на поверхности или внутри семян.

Самые стойкие вирусы, такие как вирус мозаики табака (ТоБМУ) и зелёной мозаики огурца (ССММУ), способны длительное время сохраняться на растительных остатках, в субстрате, в оборотной поливной воде капельных систем.

Несколько примеров:

• Вирус табачной мозаики (ВТМ, ТоБМУ) — передается с семенами томатов. Кроме того, источником инфекции служат растительные остатки с ВТМ в почве, в которой вирус сохраняется длительное время благодаря своей стабильности. Возбудитель может сохраняться также на конструкциях теплиц, на рабочей одежде и инструментах. Резервируется на многих видах культурных и диких растений, растущих вблизи теплиц.
• Х-вирус картофеля (РХУ) — может передаваться с семенами. источником заражения могут быть также клубни картофеля и тара, завезеные в теплицы.
• Вирус огуречной мозаики (СМУ) — передаётся многими видами сосущих вредителей: тлями, трипсами, белокрылками. Резерваторами могут быть различные виды многолетних и однолетних растений, в том числе огурец.
• Вирус скручивания листьев картофеля (РГУ). В качестве его переносчиков известны разные виды тлей. Установлено, что этот вирус передаётся с семенами томата, хотя ранее для РГУ передача механическим путем и семенами была неизвестна. Вирус поражает культурные растения, преимущественно однолетние, в умеренных зонах, распростран основной на картофеле.

В природе выживают те штаммы вируса, которые интенсивно размножаются, но вместе с тем не наносят своим хозяевам серьезных повреждений, способных вызвать гибель растения. В результате зараженное растение становится резерватором вируса, который легко распространяется переносчиками среди насаждений.

В молодом возрасте растения наиболее подвержены вирусным инфекциям и одновременно наиболее привлекательны для вредителей, в том числе и переносчиков заболеваний. Эту особенность надо учитывать при определении сроков посева культур и проведения защитных работ против вредителей. В ряде случаев это даёт возможность предотвратить развитие вирозов.

По мере роста и старения растения приобретают устойчивость. Скорость распространения заболеваний в посадках старых растений уменьшается не только за счёт их большей устойчивости, но и потому, что размножение и системное распространение вирусов происходит медленнее.

Растения, выращенные по всем правилам агротехники, более чувствительны к заражению.

Скорость распространения вирусов среди посадок зависит от биологических особенностей переносчиков. Так, установлено, что крылатые самки оранжерейной тли отдают предпочтение растениям с хлоротичной окраской. На таких растениях жизнеспособность вредителя возрастает:

что, в конечном счёте, приводит к большему росту численности переносчиков. 1.1.2. Методы диагностики вирусных болезней

Визуальная диагностика. Хотя в ряде случаев и удается достоверно установить вирусную природу заболевания по внешним признакам (например, кольцевые или линейные хлоротичные узоры на молодых листьях), их идентификация затруднена в связи с бессимптомным (латентным) характером развития болезней.

Симптоматика зависит от состояния организма, агрессивности штамма патогена, внешних условий и продолжительности пребывания вируса в клетках хозяина. Например, симптомы заболевания отчетливо выражены у растений, росших на ярком свету и при умеренной температуре, при высокой температуре и недостаточном освещении симптоматика заболевания может быть совсем не выражена.

Посветление жилок самых молодых листьев нередко является одним из первых признаков системной вирусной инфекции. Жилки становятся жёлтыми и полупрозрачными. Листья, образующиеся позже, могут быть:

• мозаичными;
• крапчатыми;
• совсем жёлтыми (хлоротичными).

Инкубационный период заболевания зависит от вида вируса, растения-хозяина и условий среды, но, в любом случае, он составляет несколько дней или недель.

Если первые симптомы вироза заметны на рассаде, то источник инфекции находился либо в семенах, либо заражение произошло при посредстве переносчика. Если заражённые растения расположены в культуре совершенно случайно или же только в рядках, посаженных из одной партии, то это говорит о том, что, скорее всего, был заражён посадочный материал. Если на отдельных участках поля обнаруживаются заболевшие растения, причем появление заражённых участков связано с почвенными различиями, имеются все основания предполагать распространение вирусов через почву.

Хотелось бы отметить также, что существуют симптомы, напоминающие поражения вирусами, но вызванные другими причинами. Сходные симптомы поражения имеют фитоплазмы и некоторые бактерии.

Точечные некрозы, вызванные поражениями растений тлями и клещами, также нередко путают с вирозами, например, большая картофельная тля вызывает скручивание, деформацию и местный хлороз листьев огурца. К появлению симптомов, сходных с вирусной инфекцией, часто приводят обычные нарушения минерального питания (например, связанные с дефицитом железа). Различные деформации органов могут вызывать гербициды гормональной природы.

Таким образом, точная идентификация по внешним признакам поражения вирусами невозможна, однозначный ответ может быть получен только с использованием инструментальных методов (иммуноферментный анализ, РСВ-анализ и т.д.).

Метод индикаторных растений является широко распространённым методом диагностики вирусных болезней и идентификации вирусов. Он основан на использовании тест-растений (индикаторных), дающих чёткие, часто строго специфичные по отношению к определённому виду вируса, симптомы. Заражение травянистых растений-индикаторов осуществляют механической инокуляцией соком. Заражение проявляется в виде местных некрозов, реже системной реакцией (изменением окраски, угнетением роста). Для вируса аспермии томата в качестве индикатора можно использовать молодые растения табака (№соНапа #]и#поза), для диагностики Х-вируса картофеля — амарант шаровидный (СотрЬгепа 51оЪоза). В ряде случаев для заражения можно использовать отдельные изолированные листья растенийиндикаторов. Соконепереносимые вирусы переносят на индикаторные растения методом прививки, так для Диагностики вирусов земляники используют прививку черешком листа на индикаторные клоны земляники лесной (Егазаца уезса). Редко для передачи вирусов используют насекомых — переносчиков и растение-паразит повилику.

Серологическая диагностика. Если теплокровному животному ввести в кровь очищенный препарат растительного вируса, иммунный аппарат животного в ответ на введение чужеродного белка (антигена) начнет вырабатывать специфические к нему антитела, связывающие антиген. В результате реакции образуется осадок (преципитат, или серум), Различимый визуально или с помощью микроскопа.

Методы диагностики: как выявить вирусную инфекцию

Для точной идентификации вирусов в растениеводстве используют лабораторные и экспресс-методы. Они позволяют обнаружить патоген на ранних стадиях, определить его вид и даже штамм. Выбор метода зависит от строения вируса, его концентрации в тканях и имеющегося оборудования.

Для быстрой оценки в полевых лабораториях применяют простые серологические тесты. Капельный метод позволяет смешать сок растения с антисывороткой на предметном стекле и оценить реакцию через несколько минут визуально или под микроскопом. Метод адсорбции повышает наглядность: антитела заранее связывают с латексом или другим крупнодисперсным материалом, что при контакте с вирусом дает хорошо заметную агглютинацию всего комплекса.

При работе со сложными или мелкими вирусами используют методы диффузии в геле. При двойной диффузии антисыворотка и очищенный сок движутся навстречу друг другу в агаре, образуя линии преципитации. При радиальной иммунодиффузии антисыворотку вводят прямо в гель, а лунки заполняют соком, получая при положительной реакции преципитаты в виде колец.

Наиболее точным количественным методом остается иммуноферментный анализ (ИФА). Этот метод основан на использовании специфических ферментных меток — фосфатазы или пероксидазы.

1. В лунки полимерной микроплаты добавляют антисыворотку и очищенный сок растения для прохождения первой иммунной реакции.
2. На полученный фиксированный комплекс антиген-антитело наносят раствор антител, связанных с ферментом (фосфатазой или пероксидазой).
3. Меченые ферментом антитела наслаиваются на детерминанты молекул антигена, обеспечивая вторую иммунную реакцию.
4. После добавления соответствующего ферментного субстрата запускается реакция каталитического расщепления, которую регистрируют с помощью фотометра по цветной реакции.

Для глубоких структурных исследований применяют электронную микроскопию. Трансмиссионный микроскоп позволяет рассмотреть форму, размеры и строение вируса в ультратонких срезах пораженных частей растений. Метод иммуноэлектронной микроскопии помогает вести серийные анализы, выявляя вирусные частицы с наслоившимися на них антителами непосредственно в соке.

Молекулярные методы анализа основаны на изучении нуклеиновых кислот патогенов. Метод ДНК-зондов распознает конкретные участки вирусной РНК по принципу комплементарности, что позволяет различать группы, виды и штаммы вирусов. При молекулярно-биологическом анализе с помощью полимеразной цепной реакции (РСК) ферменты многократно копируют видоспецифичные участки РНК, после чего их выявляют электрофорезом или иммунофлуоресценцией.

• Сила тока для разделения нуклеиновых кислот в геле — 3 мА
• Сила тока для разделения белков вируса в геле — 6 мА
• Увеличение копий фрагментов РНК в ходе ПЦР (РСК) — в миллионы раз

Частные методы включают анализ клеточных структур под световым микроскопом (метод включений). Накопление вирусов в клетках эпидермиса или волосков листьев приводит к образованию скоплений (кристаллов Ивановского) характерной формы. Для вируса табачной мозаики характерны игловидные и гексагональные кристаллы, а для Х-вируса картофеля — сферические аморфные тела. Для выявления зелёной крапчатой мозаики огурца и скручивания листьев картофеля также используют химические аналитические методы диагностики.

Стратегия защиты: почему химия бессильна и как действовать агроному

Вирусы постоянно присутствуют в растительных организмах. Сами по себе они могут не вызывать гибели хозяина, но при возникновении стрессовых условий их вредоносность резко возрастает. Растения пытаются защищаться самостоятельно, реагируя на инфекцию появлением некрозов, мозаик и деформаций органов, что ведет к падению урожайности и ухудшению качества продукции.

Ввиду отсутствия эффективных терапевтических препаратов защита посевов и посадок носит исключительно превентивный характер. Борьба с вирусными заболеваниями в полевых условиях строится на предупреждении заражения. На практике агрономы используют вакцинацию растений слабопатогенными штаммами вирусов и снижают скорость развития вирусных эпифитотий с помощью комплекса агротехнических приемов.

• При вегетативном размножении проводят периодическую прочистку посадок маточных растений. Этот метод эффективен для борьбы с вирусами, имеющими хорошо различимые симптомы.
• Обследование молодых растений и выбраковка поражённых растений с целью уничтожения первичных очагов инфекции. Тщательное обследование растений в период всходов, начала цветения и начала плодоношения.
• Термотерапия позволяет резко снизить заражённость, а иногда и полностью избавить растения от вирусов. Этот метод можно использовать как для обеззараживания вегетативных органов, так и для борьбы с инфекцией внутри семян. Температурные режимы строго специфичны и рассматриваются ниже в соответствующих разделах.
• Использование метода культивирования апикальных меристем позволяет избавиться от большинства возбудителей вирозов. Лучший эффект оздоровления от вирусных инфекций получают при комбинировании метода культуры верхушечных меристем с предварительной термотерапией или химиотерапией, при которой в питательную среду для культивирования меристем вводят антивирусные добавки (гликопротеины, полисахариды, нуклеиновые кислоты, антибиотики высших растений) или обрабатывают ими исходные растения-доноры меристем.
• Борьба с растениями — резерваторами вирусов, с переносчиками инфекции. Сокращение запаса вирусов в объектах окружающей среды (в семенах и в самих растениях, борьба с переносчиками инфекции).
• Использование иммунных сортов и гибридов. При этом селекционную работу следует проводить не только по признаку устойчивости к вирусу, но, желательно, и к его переносчику. Не меньшее значение имеет получение толерантных (выносливых) сортов, в которых системное распространение вирусов ограниченно, понижена их концентрация. Толерантность зачастую приводит к бессимптомному течению заболевания, при этом продуктивность растений практически не снижается.
• Стимулирование у растений неспецифического иммунитета с помощью элиситоров (индукторов).
• Преиммунизация, или вакцинация. Известно, что вирулентные штаммы не вызывают симптомы заболевания, если растение предварительно было заражено слабопатогенным или авирулентным штаммом вируса.

Подобная вакцинация использовалась ранее для защиты неустойчивых к ВТМ сортов и гибридов томата. Однако, в целом преиммунизация не получила широкого применения из-за возможности мугирования патоге на, усиления его вредоносности при совместном заражении с другими патогенами и из-за ряда других причин. Однако в последние годы получены хорошие вакцины не только к ВТМ, но и квирусу зелёной крапча той мозаики огурца.

Изменение генома растений за счёт включения новых генов устойчивости, полученных от доноров. При введении в клетки гена, отвечающего за синтез белка оболочки вируса табачной мозаики, он вызывает появление устойчивости табака к этому заболеванию. Так, трансгенные кабачки, несущие гены вирусных оболочек жёлтой мозаики кабачка и мозаики арбуза, не имели симптомов поражения вирусами, тогда как контрольные растения и трансгенные растения с одним геном имели явные повреждения.

Проведенные полевые испытания устойчивых к вирусам растений томатов, картофеля и многих других культур, полученных при использовании этого подхода, показали его эффективность и перспективность дальнейших исследований в данной области.

Государственный и внутрихозяйственный карантин. При импорте растений в сертификационном свидетельстве должно быть подтверждено, что материал не содержит карантинных объектов. Эффективность мероприятий внешнего и внутреннего карантина в значительной мере зависит от надежности и быстроты методов идентификации вирусов.

Организационно-хозяйственные мероприятия включают дезинфекцию режущих инструментов и орудий труда в растворе формалина, перманга-ната калия, спирта или их тепловую обработку, т.к. многие экономически значимые вирусы передаются контактным путем; работа в сменной обуви и одежде; размещение дезинфекционных ковриков перед входом в теплицу; регулярное проведение визуальных обследований растений.

Ослабление симптомов заболевания за счёт поддержания оптимального режима выращивания культуры, в том числе минерального питания. В период развития эпифитотии растения опрыскивают растворами микроэлементов, фосфорными и калийными удобрениями, которые стимулируют раннее созревание растений и как следствие — наступление возрастной устойчивости.

Последние три способа вместе являются основой так называемых профилактических мероприятий. 1.2. Вироиды

Это сравнительно новая группа вирусоподобных фитопатогенов. Фактически вироиды состоят из одной циклической молекулы РНК, которая способна реплицироваться в растении за счёт биосинтетических механизмов растения-хозяина. Вироидная РНК состоит из 25СМЮО нук-леотидов и имеет уникальную структуру. Это — кольцевая молекула с высоким процентным содержанием спаренных оснований, вследствие чего вироиды устойчивы к высоким температурам (свыше 100°) и химическим веществам (фенол, спирты и др.). Вироидные заболевания были известны ранее, но их рассматривали как вирусные или как болезни с невыясненной этиологией.

Вироиды — высокоинфекционные патогены, способные передаваться механически и с прививкой, пыльцой и семенами, насекомыми и таким растением-паразитом, как повилика. Они инфицируют преимущественно культурные растения из класса двудольных. Эффективных средств борьбы с заболеванием практически нет. Эта группа патогенов в большей степени опасна для многолетних и вегетативно размножающихся растений.

Распространению вироидных болезней способствует трудность выявления патогена в образцах исходного посадочного материала, в том *числе ввозимого из-за рубежа. В селекционных и генетических работах возможна передача вироидов с пыльцой и семенами. Эти заболевания наносят ущерб цитрусовым, хризантеме, томату, огурцу, баклажану.

Томат может инфицироваться вироидной веретеновидностью клубней картофеля (ВВКК), вироидом экзокортиса цитрусовых, а также ви-роидами томатов планта мачо и апикальной карликовости. В Голландии, а затем в других странах отмечено вироидное заболевание огурца — бледность плодов, которое заметно проявляется в летние месяцы на длинноплодных партенокарпических гибридах. В последние годы все чаще выявляется латентное поражение баклажана, бобов, огурца вирои-дами экзокортиса цитрусовых и карликовости хмеля. В целом сведения о распространении и вредоносности вироидных болезней на овощных культурах пока малочисленны.

Диагностику вироидов проводят с помощью растений-индикаторов, а также используют методы определения их нуклеиновых кислот: электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ), молекулярную гибридизацию, полимеразную цепную реакцию (ПЦР).

Основная направленность защиты от вироидов — профилактические меры: использование здорового посадочного материала, дезинфекция инструментов, выбраковка заражённых растений и т.п. Важно учитывать, что растения, поражённые вироидами, нельзя освободить от инфекции методами апикальной меристемы.

Бактерии и фитоплазмы относят к прокариотам, т.е. в клетках этих организмов нет настоящего ядра. Кольцевая молекула ДНК располагается в особой зоне клетки, называемой нуклеоидом. По строению клеточной стенки прокариоты существенно отличаются от ядерных организмов — эукариот. В составе клеточных стенок прокариот отсутствуют хитин и целлюлоза, характерные для клеток грибов или растений. Опорный каркас их клеточных стенок образован гликопептидом муреином.

Бактерии — одноклеточные организмы. Длина бактериальной клетки 1-3 мкм и ширина 0,3-0,6 мкм. Почти все фитопатогенные бактерии (ФПБ) имеют палочковидную форму (исключение —${терютусез, которые имеют нитчатое строение). Большинство ФПБ подвижно благодаря наличию жгутиков, неподвижных форм немного. Бактерии могут иметь один или несколько жгутиков. В зависимости от количества и расположения жгутиков все подвижные бактерии делят на монотрихов — с одним полярным жгугиком, лофотрихов — с пучком жгутиков на одном из концов клетки и перитрихов — со жгутиками, расположенными по всей поверхности клетки. У большинства подвижных ФПБ жгутики полярные, реже встречается перитрихальное их расположение.

Нуклеоид бактериальной клетки состоит из ДНК и распределён в цитоплазме в виде мелких зёрен, не отделён от цитоплазмы мембраной. Бактериальная клетка окружена сравнительно толстой многослойной оболочкой — клеточной стенкой, внутренний опорный слой которой при-дает бактерии определённую форму.

При неблагоприятных условиях среды, например под влиянием антибиотиков, у некоторых видов образуются так называемые Г-формы без клеточных стенок, которые, однако, при определённых условиях мо-гут восстанавливать своё первоначальное строение.

Оболочка некоторых ФПБ покрыта тонким слизистым слоем из эк-зополисахаридов, который обладает способностью разбухать, в результате чего образуется капсула. Слизистая капсула имеет большое значение для выживания бактерий в неблагоприятных условиях, они становятся устойчивыми к действию солнечных лучей, химических веществ и к другим факторам. Во влажную погоду бактериальные клетки размножаются на поверхности органов растений и накапливаются в виде скоплений слизи или экссудата.

На особенностях строения клеточной стенки бактерий основан важный метод их идентификации — окраска по Граму. Суть этого метода — окрашивание фиксированных бактериальных клеток раствором кристал-виолета и граммйода с последующим обесцвечиванием этиловым спиртом, после чего у одних видов, краситель вымывается из стенок, и они обесцвечиваются (грамотрицательные бактерии), а у других краситель прочно связывается клеточной стенкой. В результате клетки приобретают синий цвет (грамположительные бактерии). Почти все ФПБ грамотрицательные, лишь виды родов Стауфасег и 5терютусез дают положительную реакцию.

ФПБ способны размножаться при 5-10°, оптимальная температура — 25-30°, с повышением температуры до 33^0° размножение бактерий прекращается. ФПБ для активной жизнедеятельности нужна нейтральная или слабощелочная среда, что отличает их от грибов, для роста которых благоприятна кислая среда.