Методика підготовки та застосування стерильних культур в агрохімічних дослідженнях

Метод стерильних культур дозволяє точно визначити роль мікроорганізмів у живленні рослин, вивчити склад кореневих виділень та оцінити можливість засвоєння органічних сполук безпосередньо. В умовах звичайного вегетаційного досліду ґрунтова мікрофлора спотворює ці процеси, тому ізоляція кореневої системи має вирішальне значення. Для роботи використовують спеціальні герметичні посудини, всі елементи яких проходять обов'язкову термічну або хімічну обробку.

• Тиск при автоклавуванні — 2 атм
• Температура сухожарової стерилізації — 150 °С
• Час прожарювання скла та піску — 2 год
• Доза пеніциліну для середовищ — 3–10 мг/л

Підготовка лабораторного посуду та поживних середовищ

Основою для вирощування рослин служать конічні колби з жароміцного скла. Їх горло повинно щільно закриватися пробкою зі змонтованим садильним пристосуванням, що забезпечує герметичність з'єднань. Об'єм посудини підбирають індивідуально, виходячи з цілей дослідження та запланованої тривалості вирощування.

Для підготовки обладнання до досліду застосовують жорсткі температурні режими. Деталі з каучуку (наприклад, медичні зонди) попередньо кип'ятять у дистильованій воді, щоб вони не злипалися під час автоклавування. Усі нетермостійкі елементи обробляють хімічним шляхом.

• Скляний посуд і пісок стерилізують методом сухого прожарювання протягом 2 годин при температурі 150 °С.
• Поживні розчини піддають триразовій дробовій стерилізації: нагрівають до 100 °С, витримують кілька днів при кімнатній температурі й знову нагрівають.
• Елементи з поліетилену, перлонову марлю та пінопласти занурюють на 20 годин у розчин хлорного вапна, після чого промивають 50%-ним метанолом та стерильною дистильованою водою.
• Рослинні живці та кореневища стерилізують зануренням на 15–20 хвилин у 1%-ний розчин гіпохлориту натрію.

Рідкі поживні середовища також можна знепліднити додаванням антибіотиків (наприклад, пеніциліну) або ультрафіолетовим опроміненням. Такий спосіб підходить, якщо використовувані фактори не впливають на фізіологічний процес, що вивчається. Готові посудини з рослинами обов'язково прикривають спеціальними чохлами, щоб захистити поживний розчин і коріння від нагрівання та прямих сонячних променів.

Методи стерилізації насіння та техніка сівби

Перед дезінфекцією зернівки плівчастих культур (ячменю, овса, рису) необхідно повністю звільнити від колоскових і квіткових лусок. Для кращого змочування насіння попередньо занурюють на кілька хвилин у 96%-ний етиловий спирт з метою знежирення їх поверхні. Це забезпечує рівномірне покриття всієї поверхні зернівки дезінфікуючим агентом.

Агроном може обрати найбільш доступний хімічний реагент для знезараження насіння. Більшість методів потребують подальшого обов'язкового промивання стерильною дистильованою водою. Стерилізацію посівного матеріалу проводять за однією з перевірених схем:

• Занурення на 10–15 хвилин у 1%-ний водний розчин брому.
• Замочування у 0,001%-ному водному розчині етилмеркурфосфату протягом 5 хвилин.
• Витримування у 12–15%-ному розчині пероксиду водню протягом 12–15 хвилин.
• Занурення у 0,1%-ний розчин формальдегіду на 15–20 хвилин.
• Збовтування протягом 5 хвилин у суміші з 3 частин 90%-ного метанолу та 1 частини 1%-ного розчину сулеми (HgCl2) з подальшим підсушуванням перед сівбою.
• Збовтування протягом 45 хвилин у свіжоприготованому фільтраті хлорного вапна або гіпохлориту натрію (10 г активної речовини на 150 мл води) без подальшого промивання та сушіння.
• Занурення очищеного насіння соняшнику на 15 секунд або пшениці на 30 секунд у 80%-ний розчин метанолу.

Для великонасінних бобових культур підходить стерилізація у відкритому полум'ї. Насіння спочатку замочують у 95%-ному етанолі. Потім спирт підпалюють від полум'я спиртівки та витримують до повного його згоряння з поверхні зерна.

Перенесення насіння в посудини здійснюють у стерильних боксах, оснащених бактерицидними ультрафіолетовими лампами. Усі інструменти, що використовуються, та вату попередньо стерилізують. Це повністю виключає потрапляння сторонньої мікрофлори з повітря в підготовлені колби.

1. Проростіть стерильне насіння у стерильному боксі до моменту його наклювання.
2. Підготуйте посудини перед сівбою: відіжміть каучукові трубки, долийте розчин до сітки посівної трубки, обережно продуйте систему та протріть зовнішні поверхні колб спиртом.
3. Перенесіть наклюнуте насіння пінцетом через затискач Мора на сітку посівної трубки.
4. Перевірте положення насіння на сітці: якщо воно лягло корінцями вгору, акуратно поверніть його легким продуванням розчину.
5. Надягніть на нижню частину посудин подвійні захисні мішечки, встановіть їх на місце вирощування і надалі продувайте розчин щодня.

За допомогою методу стерильних культур зроблено низку важливих і цікавих відкриттів, зокрема, доведено можливість використання рослинами азоту аспарагіну, фосфору лецитину та фітину, вивчено роль кореневих виділень рослин, значення мікроорганізмів і фізіологічно кислого сульфату амонію при засвоєнні Р2О5 із фосфоритного борошна.