Методика подготовки и применения стерильных культур в агрохимических исследованиях

Метод стерильных культур позволяет точно определить роль микроорганизмов в питании растений, изучить состав корневых выделений и оценить возможность усвоения органических соединений напрямую. В условиях обычного вегетационного опыта почвенная микрофлора искажает эти процессы, поэтому изоляция корневой системы имеет решающее значение. Для работы используют специальные герметичные сосуды, все элементы которых проходят обязательную термическую или химическую обработку.

• Давление при автоклавировании — 2 атм
• Температура сухожаровой стерилизации — 150 °С
• Время прокалки стекла и песка — 2 ч
• Доза пенициллина для сред — 3–10 мг/л

Подготовка лабораторной посуды и питательных сред

Основой для выращивания растений служат конические колбы из жаропрочного стекла. Их горло должно плотно закрываться пробкой со смонтированным посадочным приспособлением, обеспечивающим герметичность соединений. Объем сосуда подбирают индивидуально, исходя из целей исследования и планируемой продолжительности выращивания.

Для подготовки оборудования к опыту применяют жесткие температурные режимы. Детали из каучука (например, медицинские зонды) предварительно кипятят в дистиллированной воде, чтобы они не слипались при автоклавировании. Все нетермостойкие элементы обрабатывают химическим путем.

• Стеклянную посуду и песок стерилизуют методом сухого прокаливания в течение 2 часов при температуре 150 °С.
• Питательные растворы подвергают трехкратной дробной стерилизации: нагревают до 100 °С, выдерживают несколько дней при комнатной температуре и снова нагревают.
• Элементы из полиэтилена, перлоновую марлю и пенопласты погружают на 20 часов в раствор хлорной извести, после чего промывают 50%-ным метанолом и стерильной дистиллированной водой.
• Растительные черенки и корневища стерилизуют погружением на 15–20 минут в 1%-ный раствор гипохлорита натрия.

Жидкие питательные среды также можно обесплодить добавлением антибиотиков (например, пенициллина) или ультрафиолетовым облучением. Такой способ подходит, если используемые факторы не влияют на изучаемый физиологический процесс. Готовые сосуды с растениями обязательно прикрывают специальными чехлами, чтобы защитить питательный раствор и корни от нагрева и прямых солнечных лучей.

Методы стерилизации семян и техника посева

Перед дезинфекцией зерновки пленчатых культур (ячменя, овса, риса) необходимо полностью освободить от колосковых и цветковых чешуй. Для лучшего смачивания семена предварительно погружают на несколько минут в 96%-ный этиловый спирт с целью обезжиривания их поверхности. Это обеспечивает равномерное покрытие всей поверхности зерновки дезинфицирующим агентом.

Агроном может выбрать наиболее доступный химический реагент для обеззараживания семян. Большинство методов требуют последующей обязательной отмывки стерильной дистиллированной водой. Стерилизацию посевного материала проводят по одной из проверенных схем:

• Погружение на 10–15 минут в 1%-ный водный раствор брома.
• Замачивание в 0,001%-ном водном растворе этилмеркурфосфата в течение 5 минут.
• Выдерживание в 12–15%-ном растворе пероксида водорода в течение 12–15 минут.
• Погружение в 0,1%-ный раствор формальдегида на 15–20 минут.
• Встряхивание в течение 5 минут в смеси из 3 частей 90%-ного метанола и 1 части 1%-ного раствора сулемы (HgCl2) с последующим подсушиванием перед посевом.
• Встряхивание в течение 45 минут в свежеприготовленном фильтрате хлорной извести или гипохлорита натрия (10 г активного вещества на 150 мл воды) без последующего промывания и сушки.
• Погружение очищенных семян подсолнечника на 15 секунд или пшеницы на 30 секунд в 80%-ный раствор метанола.

Для крупносемянных бобовых культур подходит стерилизация в открытом пламени. Семена сначала замачивают в 95%-ном этаноле. Затем спирт поджигают от пламени спиртовки и выдерживают до полного его сгорания с поверхности зерна.

Перенос семян в сосуды осуществляют в стерильных боксах, оснащенных бактерицидными ультрафиолетовыми лампами. Все используемые инструменты и вату предварительно стерилизуют. Это полностью исключает попадание сторонней микрофлоры из воздуха в подготовленные колбы.

1. Прорастите стерильные семена в стерильном боксе до момента их наклевывания.
2. Подготовьте сосуды перед посевом: отжмите каучуковые трубки, долейте раствор до сетки посевной трубки, осторожно продуйте систему и протрите внешние поверхности колб спиртом.
3. Перенесите наклюнувшиеся семена пинцетом через зажим Мора на сетку посевной трубки.
4. Проверьте положение семян на сетке: если они легли корешками вверх, аккуратно поверните их легким продуванием раствора.
5. Наденьте на нижнюю часть сосудов двойные защитные мешочки, установите их на место выращивания и в дальнейшем продувайте раствор ежедневно.

С помощью метода стерильных культур сделан ряд важных и интересных открытий, в частности, доказана возможность использования растениями азота аспарагина, фосфора лецитина и фитина, изучены роль корневых выделений растений, значение микроорганизмов и физиологически кислого сульфата аммония при усвоении Р2О5 из фосфоритной муки.