Методи ідентифікації та кількісного визначення білків в агрохімії

Якість урожаю зернових та кормових культур безпосередньо залежить від вмісту в них білка. Щоб оцінити поживну цінність продукції або проконтролювати азотне живлення рослин, лабораторії проводять якісний та кількісний аналіз рослинних проб. В основі цих досліджень лежать хімічні реакції та фізико-хімічні методи розділення молекул.

Якісні реакції: як визначити склад білка

Для швидкої ідентифікації білків у рослинній сировині використовують кольорові реакції та реакції осадження. Кольорові тести дозволяють виявити як сам білок, так і окремі критично важливі амінокислоти, що визначають кормову цінність культури. Осадження необхідне, щоб перевести нестабільні білки у тверду фазу для їхнього подальшого вивчення.

Якісний склад білків визначають за допомогою таких специфічних реакцій:

• Біуретова реакція: дає синьо-фіолетове або червоно-фіолетове забарвлення при додаванні до водного розчину білка лугу та міді сірчанокислої, вказуючи на наявність пептидних зв'язків CO–NH.
• Нінгідринова реакція: універсальний тест на α-амінокислоти.
• Ксантопротеїнова реакція: дає жовте забарвлення при взаємодії з концентрованою азотною кислотою, підтверджуючи присутність циклічних амінокислот (тирозину, фенілаланіну, триптофану).
• Реакція Міллона: дає жовто-червоне забарвлення при нагріванні з реактивом з азотнокислих та азотистокислих солей ртуті в азотній кислоті (Hg(NI3)2+HNO3+HNO2), вказуючи на фенільну групу тирозину.
• Реакція Адамкевича та Вуазене: синьо-фіолетове забарвлення при додаванні гліоксилової кислоти в сірчаній кислоті, що доводить наявність триптофану.
• Реакція Паулі: червоне забарвлення з діазотованою сульфаніловою кислотою в лужному середовищі (тест на гістидин і тирозин).
• Реакція Сакагучі: малиново-червоний колір після обробки гіпохлоритом натрію та β-нафтолом, що вказує на аргінін.
• Нітропрусидна реакція: специфічний тест на цистеїн.

Загальна схема виділення білків із рослинної проби включає три послідовні етапи:

1. Подрібнення та гомогенізація вихідного рослинного матеріалу.
2. Екстрагування (вилучення) білків рідким розчинником.
3. Виділення, очищення та отримання білка в індивідуальному стані.

Кількісні методи та розділення білкових фракцій

Для точного визначення білкових фракцій та загального вмісту азоту в рослинах лабораторії використовують хроматографію, електрофорез та класичний метод К'єльдаля. Вибір методу залежить від завдань аналізу: чи потрібно розділити білки за розміром молекул, їхнім зарядом або дізнатися сумарний відсоток білка в сухій речовині.

Розділення білків проводять такими методами:

• Адсорбційна хроматографія: розділяє білки за полярністю на колонці з адсорбентом при елююванні буферним розчином.
• Розподільна хроматографія: використовує нерухомий водний шар на силікагелі або папері для розділення речовин за швидкістю їхнього переміщення.
• Іонообмінна хроматографія: розділяє білки за їхнім загальним зарядом (у нейтральному середовищі при pH 7 позитивно заряджені молекули зв'язуються катіонообмінником, негативно заряджені — аніонообмінником).
• Афінна хроматографія: заснована на вибірковому зв'язуванні білків зі специфічними лігандами (наприклад, глюкозою), іммобілізованими на носії.
• Гель-фільтрація (метод молекулярних сит): пропускання суміші через колонку з гелем сефадексу, агарози, полістиролу або через пористі скляні кульки та кварц (порасил) для розділення за розміром молекул.
• Електрофорез: розділення заряджених молекул в електричному полі за швидкістю руху, яка залежить від відношення заряду до маси.

Щоб визначити загальний вміст білка в рослинах, вимірюють кількість азоту методом К'єльдаля. Цей метод є стандартним в агрохімії та включає суворо послідовні хімічні операції.

1. Кип'ятіння наважки рослинного матеріалу з концентрованою сірчаною кислотою у присутності каталізатора (сульфату міді або сульфату ртуті) для переведення білкового азоту в аміак.
2. Відгонка утвореного аміаку з парою з реакційної суміші.
3. Кількісне визначення аміаку титруванням або колориметруванням із використанням реактиву Несслера.
4. Перерахунок кількості знайденого азоту в білок за допомогою коефіцієнтів, установлених для конкретної культури.

Основні хімічні орієнтири для проведення аналізів білкових фракцій наведені нижче:

• Нейтральне середовище для іонообміну — pH 7
• Реактив Міллона — Hg(NI3)2+HNO3+HNO2
• Реактив Несслера — лужний розчин меркуріойодиду калію

Для точної оцінки якості врожаю та контролю азотного живлення рослин агрохімічні лабораторії використовують різні методи визначення азоту. Ці аналізи дозволяють розрахувати вміст білка в досліджуваних рослинних пробах. Окрім класичних підходів, на практиці застосовуються технології, що прискорюють отримання результатів.

У лабораторній практиці добре зарекомендували себе три альтернативні методи. Перший — метод Дюма, заснований на розкладанні органічної сполуки в атмосфері оксиду вуглецю до газоподібного стану з наступним вимірюванням об'єму азоту. Другий — колориметричний спосіб визначення азоту з фенолятгіпохлоритом на приладі «Технікон». Тут вимірюється інтенсивність синьо-блакитного забарвлення, яке утворюється при взаємодії сульфату амонію, що виділяється в процесі мінералізації зразка, з лужним розчином фенолу та гіпохлориту.

Оптичні та експрес-методи визначення білка

Для швидкого аналізу рослинних зразків широке поширення отримав метод інфрачервоної спектроскопії. В його основі лежить здатність білків поглинати світло з певною довжиною хвилі. Прилади-аналізатори вимірюють інтенсивність відбиття цього випромінювання від проби. Такий безконтактний метод дозволяє оперативно оцінювати якість продукції.

Також відомі інші методи кількісного визначення білка в лабораторії. Вони базуються на зміні оптичних і фізичних властивостей розчинів при контакті з білковими молекулами. Агрономи використовують такі підходи:

• Нефелометричний метод — заснований на фіксації різного ступеня помутніння розчину.
• Адсорбційний метод — використовує здатність білків адсорбувати барвники (кумассі синій R-250, амідочорний).
• Визначення за показником заломлення — розраховує концентрацію за здатністю білків заломлювати промені світла.